RCL（VSVG） 基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒（qPCR 熒光探針法）說明書

◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A（博日）
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480
配合不同機(jī)型使用時(shí)，請(qǐng)注意選擇適配的參比染料 ROX

需要準(zhǔn)備材料：

◆ 1.5mL 或 2mL 無菌低吸附離心管
◆ 離心機(jī)
◆ 熒光定量 PCR 儀
◆ 與 PCR 儀適配的 96 孔 qPCR 板或八聯(lián)排管
◆ 震蕩器
◆ 1000μL，200μL，10μL 無菌低吸附帶濾芯槍頭
◆ 各規(guī)格移液器（如 1000μL，200μL，10μL，2.5μL 等）

操作步驟：

一、 樣品前處理

詳見血液 / 組織 / 細(xì)胞基因組 DNA 純化提取試劑盒（貨號(hào)為 HG-NA100）操作說明書。

二、qPCR 操作步驟

1. 定量參考品及 NTC/NCS 的制備

1.1 定量參考品：取出RCL定量參考品、DNA 稀釋液置于冰上融化；待完i全融化后，輕微振蕩混勻，瞬時(shí)離心；

1.2 取 6 支干凈的 1.5mL 離心管，分別標(biāo)記為 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5；

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋過程如下表：

1.4 NTC 的制備：100uL DNA 稀釋液；

1.5 NCS 的制備 : 隨樣品取 100μL DNA 稀釋液進(jìn)行樣品預(yù)處理。

2. q-PCR 反應(yīng)液的制備和加樣

2.1 根據(jù)所需檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品數(shù)量（一般做 3 個(gè)復(fù)孔），計(jì)算所需孔數(shù)：

    反應(yīng)孔數(shù) =（5 個(gè)濃度梯度的標(biāo)曲 +2 個(gè)陰性對(duì)照 NTC 和 NCS + 待測(cè)樣品）×3

2.2 根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次所需的 qPCR Mix 總量：

    qPCR Mix =（反應(yīng)孔數(shù) +2 或 3）× 15μL（2 或 3 為操作損失量）

2.3 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按表 4 所示配制 qPCR Mix。

3. 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按下表所示加樣（總體積20μL）：

各反應(yīng)孔加樣示例

4.實(shí)驗(yàn)需使用qPCR實(shí)驗(yàn)專用的八聯(lián)管或者96孔板進(jìn)行反應(yīng)，需去除反應(yīng)體系中的氣泡，并離心將液體離至管底準(zhǔn)備反應(yīng)。
5.反應(yīng)孔排版示例

96孔板排版示例

三、 qPCR反應(yīng)程序和參數(shù)設(shè)置

（以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例。）

1.創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)反應(yīng)程序，設(shè)置兩步法反應(yīng)程序如下表：

2.創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)反應(yīng)板，點(diǎn)擊Select Fluorophores選擇熒光FAM；在反應(yīng)板圖表中，選擇樣品孔，在Sample Type中下拉選擇Unknow，勾選熒光FAM，Target Name命名為RCL；輸入每個(gè)樣品的重復(fù)次數(shù)及Sample Name；

3.在反應(yīng)板圖表中，選擇標(biāo)曲孔，在Sample Type中下拉選擇Standard，勾選熒光FAM，Target Name命名為RCL；輸入每個(gè)稀釋梯度的重復(fù)次數(shù)及Sample Name。分別在ST1、ST2、ST3、ST4、ST5的Concentration一欄賦值為1.00E+05、1.00E+04、1.00E+03、1.00E+02、1.00E+01（單位為copies/μL）。

4.點(diǎn)擊Run界面“Start Run"按鈕進(jìn)行PCR測(cè)定。

四、 qPCR結(jié)果分析

以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例
1. 點(diǎn)擊資料分析視窗Quantitation，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）、擴(kuò)增效率（Effect）、R²。
2. 在視窗Quantitation Data 中，SQ Mean 一欄可讀取無模板對(duì)照NTC、NCS、待測(cè)樣本的檢測(cè)值，單位為copies/μL。
3. 數(shù)據(jù)可靠性評(píng)估：
• 三個(gè)平行孔間Ct值差應(yīng)小于1.0，Ct值大于35的孔除外；
• 陰性對(duì)照NTC和NCS的CT值都應(yīng)大于標(biāo)曲最i低濃度的CT值或根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自身驗(yàn)證結(jié)果設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)；
• 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)R²≥0.98，擴(kuò)增效率85%~110%之間；
• ERC回收率在50%~150%之間（加標(biāo)回收率=ERC/(0.9*樣品+0.1*ST3)。

4. RCL 陰性判定標(biāo)準(zhǔn):樣本3個(gè)平行孔無 Ct 值或有 2個(gè)孔無 Ct 值和1個(gè)孔有 Ct 值且檢出孔的 Ct 值大于LLOQ 的 Ct 值。

5.RCL 陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):樣本2個(gè)或以上孔檢出 VSV-G基因拷貝數(shù)不低于 10copies/uL，判定為 VSV-G 基因陽性。

注意事項(xiàng)：

1. 本試劑盒已通過穩(wěn)定性（凍融等因素）的驗(yàn)證，無需分裝。 

2. 陰性樣品和陽性樣品（參考品和待測(cè)樣品等）的配制環(huán)境需區(qū)分區(qū)域，不可在一個(gè)區(qū)域內(nèi)操作，配制人員需穿戴整齊，戴好口罩、手套和穿好潔凈服。

3. 注意在不同加樣步驟間及時(shí)更換吸頭，避免交叉污染，避免長(zhǎng)時(shí)開蓋。 

4. 試劑盒必須在有效期內(nèi)使用。 

5. 試劑盒內(nèi)所有組分建議在低溫環(huán)境融化后使用。 

6. 只有嚴(yán)格遵守說明書的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證最佳檢測(cè)效果。 

7. 盡量在當(dāng)天完成樣本前處理純化后立即進(jìn)行后續(xù)qPCR檢測(cè)，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 

8. 最終的試驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、操作者的操作方法及試驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)。 

9. 公司只對(duì)試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對(duì)因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請(qǐng)使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。 

10. 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷。