CAR/TCR  基因拷貝數(shù)檢測試劑盒（多重 qPCR- 熒光探針法）說明書

◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A（博日）
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480
配合不同機型使用時，請注意選擇適配的參比染料 ROX

需要準備材料：

◆ 1.5mL 或 2mL 無菌低吸附離心管
◆ 離心機
◆ 熒光定量 PCR 儀
◆ 與 PCR 儀適配的 96 孔 qPCR 板或八聯(lián)排管
◆ 震蕩器
◆ 1000μL，200μL，10μL 無菌低吸附帶濾芯槍頭
◆ 各規(guī)格移液器（如 1000μL，200μL，10μL，2.5μL 等）

操作步驟：

一、 樣品前處理

詳見血液 / 組織 / 細胞基因組 DNA 純化提取試劑盒（貨號為 HG-NA100）操作說明書。

二、qPCR 操作步驟

1. 定量參考品及 NTC/NCS 的制備

1.1 定量參考品：取出 CAR 定量參考品、DNA 稀釋液置于冰上融化；待完i全融化后，輕微振蕩混勻，瞬時離心；

1.2 取 7 支干凈的 1.5mL 離心管，分別標記為 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6；

1.3 標準品稀釋過程如下表：

1.4 NTC 的制備：100uL DNA 稀釋液；

1.5 NCS 的制備 : 隨樣品取 100μL DNA 稀釋液進行樣品預處理。

2. q-PCR 反應液的制備和加樣

2.1 根據(jù)所需檢測的標準樣品和待測樣品數(shù)量（一般做 3 個復孔），計算所需孔數(shù)：

    反應孔數(shù) =（6 個濃度梯度的標曲 +2 個陰性對照 NTC 和 NCS + 待測樣品）×3

2.2 根據(jù)反應孔數(shù)計算本次所需的 qPCR Mix 總量：

    qPCR Mix =（反應孔數(shù) +2 或 3）× 15μL（2 或 3 為操作損失量）

2.3 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按下表所示配制 qPCR Mix。

3. 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按下表所示加樣（總體積20μL）：

各反應孔加樣示例

4.實驗需使用qPCR實驗專用的八聯(lián)管或者96孔板進行反應，需去除反應體系中的氣泡，并離心將液體離至管底準備反應。
5.反應孔排版示例

96孔板排版示例

三、 qPCR反應程序和參數(shù)設置

（以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例。）

1.創(chuàng)建實驗反應程序，設置兩步法反應程序如下表：

2.創(chuàng)建實驗反應板，點擊 Select Fluorophores 選擇熒光 FAM 和 Cy5；

在反應板圖表中，選擇樣品孔，在Sample Type中下拉選擇Unknow，勾選熒光FAM，Target Name命名為Human-DNA；輸入每個樣品的重復次數(shù)及Sample Name；

在反應板圖表中，選擇標曲孔，在 SampleType 中下拉選擇 Standard，勾選熒光 FAM，Target Name 命名為 CAR；勾選熒光 Cy5，Target Name 命名為 RFG，輸入每個稀釋梯度的重復次數(shù)及 SampleName。并且分別在 ST1， ST2， ST3，ST4，ST5，ST6 的 Concentration 一欄賦值為 3E+06、3E+05、3E+04、3E+03、3E+02、3E+01( 單位為 copies/uL) 。

3.點擊 Run 界面“Start Run"按鈕進行 PCR 測定。4.點擊Run界面“Start Run"按鈕進行PCR測定。

四、 qPCR結果分析

以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例
1. 點擊資料分析視窗Quantitation，可讀取標準曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）、擴增效率（Effect）、R²。
2. 在視窗Quantitation Data 中，SQ Mean 一欄可讀取無模板對照NTC、NCS、待測樣本的檢測值，單位為copies/μL。
3. 數(shù)據(jù)可靠性評估：
• 三個平行孔間Ct值差應小于1.0，Ct值大于35的孔除外；
• 陰性對照NTC和NCS的CT值都應大于標曲最i低濃度的CT值或根據(jù)實驗室自身驗證結果設定標準；
• 標準曲線線性相關系數(shù)R²≥0.98，擴增效率85%~110%之間；
• ERC回收率在50%~150%之間（加標回收率=ERC/(0.9*樣品+0.1*ST3)。

4. 結果計算：CAR 拷貝數(shù) / 細胞 = 2 x CAR / RFG

注意事項：

1. 本試劑盒已通過穩(wěn)定性（凍融等因素）的驗證，無需分裝。
2. 陰性樣品和陽性樣品（參考品和待測樣品等）的配制環(huán)境需區(qū)分區(qū)域，不可在一個區(qū)域內操作，配制人員需穿戴整齊，戴
好口罩、手套和穿好潔凈服。
3. 注意在不同加樣步驟間及時更換吸頭，避免交叉污染，避免長時開蓋。
4. 試劑盒必須在有效期內使用。
5. 試劑盒內所有組分建議在低溫環(huán)境融化后使用。
6. 只有嚴格遵守說明書的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證優(yōu)良檢測效果。
7. 盡量在當天完成樣本前處理純化后立即進行后續(xù)qPCR檢測，以保證檢測結果的準確性。
8. 最終的試驗結果與試劑的有效性、操作者的操作方法及試驗環(huán)境密切相關。
9. 公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，
預留充足的樣本。
10. 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷。