樣本量過少

增加起始樣本量。對于微量樣本，可加入糖原（20 mg/mL）或線性丙烯酰胺作為助沉劑。

樣本裂解/勻漿不徹-底

確保組織研磨成粉末狀，或細胞被充分吹打裂解。對于難裂解組織，可增加裂解液用量或延長孵育時間。

沉淀時丟失

尤其注意微量RNA沉淀可能肉眼不可見。棄上清時務(wù)必小心，可保留少許上清。離心后標記沉淀可能的位置。

RNA未完-全溶解

避免沉淀過度干燥。溶解時用移液器反復(fù)吹打，或在55-60°C孵育10分鐘（注意不要加熱過久）。

水相回收時未全部回收

在TRIzol法中，若擔(dān)心DNA污染而只取少量水相，會犧牲得率?？稍诩兌仍试S范圍內(nèi)，適當(dāng)多取一些。

蛋白質(zhì)污染

1. 在吸取水相時，混入了中間的蛋白質(zhì)相層。下次操作時更小心，留出更多安全距離。2. 對于富含蛋白的樣本，可增加氯仿抽提次數(shù)（TRIzol法）。

苯酚殘留

1. 確保吸取的上層水相未接觸下層酚相。2. 增加75%乙醇的洗滌次數(shù)或用量，確保洗凈鹽分和殘留試劑。

測量溶液pH值過低

使用TE緩沖液（pH 8.0）代替RNase-free水稀釋樣品和空白對照，可校正pH導(dǎo)致的比值偏低。

異硫氰酸胍殘留

裂解液中的胍鹽如果未被充分洗掉，會強烈吸收230 nm。用75%乙醇徹-底洗滌沉淀2-3次，并確保最后-次吸盡殘留乙醇。

多糖污染

對于植物組織，可在RNA沉淀后，使用高鹽溶液（如3M乙酸鈉，pH 5.2）配合乙醇進行沉淀，以沉淀RNA而讓多糖留在上清。

樣品不新鮮或反復(fù)凍融

采集樣品后應(yīng)立即處理或速凍后保存于-80°C，避免在-20°C長期存放。提取的RNA應(yīng)小份分裝，避免反復(fù)凍融。

操作環(huán)境中存在RNase污染

回顧專題一：檢查手套是否常換，耗材是否RNase-free，臺面是否清潔。使用RNase清除劑處理所有表面。

提取過程中內(nèi)源性RNase未被及時抑制

確保樣本一接觸裂解液就立即充分混勻，因為裂解液中的強變性劑能迅速滅活RNase。對于富含RNase的組織（如胰腺、脾臟），操作要更快。

樣品在錯誤溫度下存放

裂解前的勻漿步驟應(yīng)在冰上或液氮中進行。裂解后的樣品在加入有機溶劑前，室溫孵育時間不宜過長。

吸取水相時混入了中間相

TRIzol法中，水相和中間相界限有時不清。下次操作時，寧可少取，也不要貪多。

樣品起始量過大

過多的樣本量超過了裂解試劑的緩沖能力，導(dǎo)致DNA未能有效分離。減少樣本起始量。

裂解液與氯仿混勻不充分

加入氯仿后，務(wù)必-用手劇烈搖晃15秒，確保兩相充分接觸，使DNA完-全進入中間相。

不可避免的DNA殘留

對于對DNA污染容忍度極低的下游實驗（如RT-qPCR跨越內(nèi)含子的引物設(shè)計），可在RNA溶解后，用無RNase的DNase I進行消化處理，然后再進行純化回收。

RNA沉淀過度干燥

這是常見原因。干燥至沉淀變透明即可，切勿等到干裂。

加入的水量不足

對于大量RNA沉淀，需加入足夠體積的水（如50-100 μL）。

溶解不充分

加入水后，可在室溫放置幾分鐘，然后用移液器反復(fù)吹打，或溫和渦旋。必要時55-60°C助溶，但時間宜短。