慢病毒滴度 p24快速ELISA檢測試劑盒說明書

貨號：HG- P001L

產(chǎn)品簡介：

在慢病毒載體制備的工藝開發(fā)過程中,需關(guān)注病毒載體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立,包括病毒滴度、宿主細(xì)胞 DNA殘留、宿主細(xì)胞蛋白殘留。支原體等檢測指標(biāo)。測量病毒滴度對于病毒使用以及進(jìn)行感染細(xì)胞是至關(guān)重要的，也是慢病毒載體生產(chǎn)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)。滴度檢測包括物理滴度(病毒載體總顆粒數(shù))和轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度(病毒載體感染性顆粒數(shù))。物理滴度:載體特定蛋白/核酸的定量可用于載體顆粒數(shù)量(物理滴度)的估計。也即總顆粒數(shù)和基因組滴度表示病毒的物理數(shù)量,為物理滴度。例如，HIV-1衍生的慢病毒載體,可通過 ELISA方法檢測病毒載體樣本中的 p24 蛋白從而進(jìn)行物理滴度的檢測，也可以通過 qPCR 的方法檢測載體基因組 RNA拷貝數(shù)而實現(xiàn)物理滴度的檢測。
本試劑盒采用雙抗體夾心法(一種 ELISA 法)檢測供試品中的 p24總含量，通過換算，得到 p24 的物理滴度。使用預(yù)先包被有抗 HIV-1 p24 捕獲抗體的微孔板，反應(yīng)孔內(nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣本，同時加入抗 HIV-1 p24二抗，室溫孵育，形成抗體-抗原二抗復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合物，通過 HRP 催化底物 TMB 產(chǎn)生藍(lán)色，終止后使用酶標(biāo)儀在 450 nm~630 nm 波長下檢測吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算供試品中 p24 含量。
檢測范圍:1.37 ng/mL~1000 ng/mL

規(guī)格：

96 T

應(yīng)用：

適用于快速檢測基于HIV-1的慢病毒的p24蛋白含量測定。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品儲存條件與有限期：

所有試劑在2 ~ 8℃條件下有效期為12個月，開封后，未使用完的試劑盒，仍在規(guī)定儲存條件下保存。

需要準(zhǔn)備的試劑、耗材與設(shè)備：

實驗前請準(zhǔn)備好下列試劑、耗材與設(shè)備：

◆?生物安全柜
◆?酶標(biāo)儀（至少配備450nm和630nm波長）
◆?各規(guī)格移液器（如1000 μL，200 μL，10 μL等）
◆?渦旋儀
◆?吸水紙
◆?恒溫振蕩孵育器
◆?1000 μL，200 μL，10μL 等低吸附槍頭
◆?離心機(jī)
◆?去離子水

實驗步驟：

1.檢測流程圖

總時長約1小時

2. 準(zhǔn)備工作

1. 打開生物安全柜紫外燈，照射30分鐘。
2. 試劑盒提前從2-8℃冰箱取出后，于室溫放置至平衡（30分鐘及以上），保證本次實驗檢測所需試劑。試劑盒開啟時要標(biāo)注開啟日期，優(yōu)先使用先開啟的試劑盒，同一批號試劑盒可以混用，不同批號試劑盒不可混用。準(zhǔn)備本次實驗所需要的Coated Plate，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求于2 ~ 8℃保存，以備下次使用。
3. 洗滌液配制：用去離子水將10×PBST Wash Buffer 稀釋至1×Wash Buffer，混勻，即得。
4. 供試品溶液配制：供試品的稀釋需在生物安全柜內(nèi)操作，使用Sample Diluent Buffer進(jìn)行稀釋。供試品稀釋或加樣前，確認(rèn)供試品已溶解并平衡室溫，操作前使用90%體積量程的移液器連續(xù)勻速吹打混勻20次或低速振蕩混勻，待供試品樣本充分混勻后使用。稀釋倍數(shù)可根據(jù)實際濃度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。注意：單步稀釋倍數(shù)不應(yīng)高于10倍。
5. 標(biāo)準(zhǔn)品濃度確認(rèn)：

6.  內(nèi)控溶液配制（200 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品）：取80 μL Sample Diluent Buffer，加入1000 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)品（S1）20 μL，混勻即得。
7.  加標(biāo)質(zhì)控溶液配制：取供試品溶液20 μL，加入20 μL 的200 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品，混勻，即得。
8.  陰性對照樣本：取Sample Diluent Buffer直接檢測。
9. 加樣板布局（僅供參考，可根據(jù)實驗實際需要進(jìn)行調(diào)整）：

10.加樣：取出已平衡至室溫的Coated Plate，依次加入Virus Lysis，50 μL/孔；再分別加入HIV-1 p24 Standard 0 ng/mL、1.37 ng/mL、4.12 ng/mL、12.35 ng/mL、37.04 ng/mL、111.11 ng/mL、333.33 ng/mL、1000 ng/mL、供試品溶液、陰
性對照、加標(biāo)質(zhì)控溶液、內(nèi)控溶液，各10 μL/孔，平行2孔。
11.加酶標(biāo)二抗：每孔加50 μL Anti HIV-1 p24+HRP。
12.孵育：用封板膜封板后，放置恒溫震蕩孵育器中，調(diào)節(jié)參數(shù)，室溫18 ~ 25℃，500轉(zhuǎn)/分鐘，孵育30分鐘。
13.洗滌：在生物安全柜內(nèi)，小心揭掉封板膜，將板孔內(nèi)液體傾倒于廢液缸中，在事先準(zhǔn)備好的吸水紙上將板孔內(nèi)液體拍干，每孔加入300 μL 1× Wash Buffer，靜置30秒后，將板孔內(nèi)液體傾倒于廢液缸中，在吸水紙上拍干（確保孔內(nèi)無殘留液體），如此重復(fù)4次。
14. 顯色：加入Color Reagent，各100 μL/ 孔。此步驟需要在生物安全柜中避光操作（關(guān)閉照明）。
15. 孵育：用封口膜封板后置恒溫震蕩孵育器中，調(diào)節(jié)參數(shù)，室溫18 ~ 25℃避光孵育5 ~ 10分鐘。
16. 終止：孵育結(jié)束后，加Stop Solution各100 μL/孔，在25分鐘內(nèi)，用酶標(biāo)儀于450nm檢測波長、630nm 參比波長下讀取吸光度。

結(jié)果分析：

1. 以標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，采用四參數(shù)擬合方式對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行擬合。

2. 示意圖：

3. 結(jié)果計算

1). 供試品最終p24含量（ng/mL）計算公式
?  供試品最終p24含量（ng/mL）=稀釋倍數(shù)×四參數(shù)擬合供試品p24含量
2). 病毒顆粒數(shù)（PP/mL）計算公式
?病毒顆粒數(shù)（PP/mL）=供試品最終Lenti-p24含量×1.25×10⁷
3). 內(nèi)控溶液回收率計算

回收率%  = 內(nèi)控檢測濃度/內(nèi)控理論濃度 × 100%

4). 加標(biāo)回收率的計算

回收率% =（加標(biāo)檢測濃度×總體積）-（供試品檢測濃度×供試品體積）/加標(biāo)理論濃度 × 加標(biāo)體積 × 100%

4. 系統(tǒng)適用性

1. 對于檢測值≥1.37 ng/mL的檢測復(fù)孔（包括標(biāo)準(zhǔn)品，加標(biāo)質(zhì)控樣品和檢測樣品），復(fù)孔OD CV值需≤20%；
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2 > 0.980；
3. 內(nèi)控溶液回收率為70% ~ 130%
4. 加標(biāo)質(zhì)控樣本的回收率在70% ~ 130%之間；