自激活——Y1H最常見的“假陽(yáng)性陷阱"

當(dāng)Prey蛋白自身具有轉(zhuǎn)錄激活能力，或者Bait序列被酵母內(nèi)源因子非特異性結(jié)合時(shí)，即使沒(méi)有DNA-蛋白特異互作，報(bào)告基因也可能被激活，這就是“自激活"。不做好自激活檢測(cè)，篩選出的陽(yáng)性克隆幾乎全是噪音。

第一類對(duì)照：空載體陰性對(duì)照

為每個(gè)Bait菌株設(shè)置“空Prey載體"轉(zhuǎn)化組，即只表達(dá)AD而不融合任何待測(cè)蛋白。若該組仍出現(xiàn)報(bào)告基因激活，說(shuō)明Bait本身或AD背景存在非特異性激活。所有實(shí)驗(yàn)條件（轉(zhuǎn)化量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基等）必須與實(shí)驗(yàn)組完-全一致，否則陰對(duì)照無(wú)意義。

第二類對(duì)照：平行重復(fù)與閾值設(shè)定

至少進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，用陽(yáng)性信號(hào)的平均值設(shè)置判定閾值。建議將陰性對(duì)照組的信號(hào)強(qiáng)度+3倍標(biāo)準(zhǔn)差設(shè)為截?cái)嘀?，低于此值者為真互作候選。切忌僅憑單次菌落顏色深淺下結(jié)論。

第三類對(duì)照：多報(bào)告基因交叉驗(yàn)證

單一報(bào)告基因可能因代謝波動(dòng)出現(xiàn)假信號(hào)?？稍谕?/span>Bait菌株中整合兩種不同報(bào)告基因（如HIS3和LacZ），只有兩者同時(shí)激活才視為陽(yáng)性。這樣能極大剔除假陽(yáng)性，提高數(shù)據(jù)可信度。

做好這三類對(duì)照，你的酵母單雜交篩選結(jié)果才能經(jīng)得起后續(xù)EMSA、ChIP等實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

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