免疫共沉淀（Co-IP）是驗證蛋白相互作用的經(jīng)典技術(shù)，但實驗操作對條件要求嚴(yán)苛，全程需保持非變性環(huán)境，任何一個步驟的疏漏都可能導(dǎo)致實驗失敗。本文整理了免疫共沉淀標(biāo)準(zhǔn)實驗流程，從蛋白提取到蛋白洗脫全程手把手講解，新手也能輕松上手。

實驗前提：全程在 4℃冰箱或冰上操作，所有與樣本接觸的試劑、離心管、槍頭均需提前預(yù)冷；裂解液、洗滌緩沖液中需加入新鮮的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，防止蛋白降解和磷酸化修飾丟失。

步驟 1：細(xì)胞 / 組織非變性裂解，提取可溶性蛋白復(fù)合物

1. 取培養(yǎng)至對數(shù)期的細(xì)胞（或預(yù)處理后的組織樣本），用預(yù)冷的 PBS 輕輕洗滌 2 次，徹-底棄盡上清，避免殘留 PBS 稀釋裂解液；

2. 向樣本中加入非變性裂解液（常用含 1% NP-40 或 Triton X-100 的裂解液），裂解液體積根據(jù)樣本量調(diào)整（如 6cm 培養(yǎng)皿加 200-300μl）；

3. 冰上裂解 30min，期間每 10min 輕輕顛倒離心管一次，讓裂解液與樣本充分接觸；

4. 4℃、12000rpm 離心 10min，吸取上清液至新的預(yù)冷離心管中，棄去底部的細(xì)胞 / 組織碎片沉淀；

5. 留取少量上清液作為Input 樣品（陽性對照，驗證目的蛋白正常表達(dá)），-20℃暫存?zhèn)溆谩?/span>

步驟 2：預(yù)清除處理，降低非特異性結(jié)合（關(guān)鍵步驟）

向提取的蛋白上清液中加入無抗體偶聯(lián)的對照樹脂 / 磁珠（蛋白 A/G 磁珠），4℃緩慢搖床孵育 30min；磁珠會吸附裂解液中的雜蛋白、細(xì)胞碎片等易產(chǎn)生非特異性結(jié)合的物質(zhì)，孵育后通過磁力架吸附磁珠，將上清液轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷離心管中，棄去吸附了雜蛋白的磁珠。
? 這一步是減少實驗假陽性、降低背景的核心，不可省略。

步驟 3：抗體孵育，形成可溶性抗體 - 蛋白復(fù)合物

1. 將預(yù)清除后的上清液平均分為實驗組和IgG 對照組（兩組體積一致，排除抗體非特異性結(jié)合）；

2. 實驗組加入適量誘餌蛋白的特異性抗體（常規(guī)用量 1-5μg / 樣本，根據(jù)抗體效價調(diào)整），IgG 對照組加入等量的同物種非特異性 IgG；

3. 兩組均在 4℃緩慢搖床孵育 2-4h，若誘餌蛋白豐度低，可孵育過夜，提高抗體與誘餌蛋白的結(jié)合效率。

步驟 4：固相載體孵育，富集蛋白復(fù)合物

向?qū)嶒灲M和 IgG 對照組中分別加入預(yù)冷的蛋白 A/G 瓊脂糖珠 / 磁珠，4℃緩慢搖床孵育 2-4h；蛋白 A/G 會特異性結(jié)合抗體的 Fc 段，形成 “磁珠 - 蛋白 A/G - 抗體 - 誘餌蛋白 - 互作蛋白" 的固相復(fù)合物，完成蛋白沉淀的核心過程。

步驟 5：多次洗滌，去除未結(jié)合的雜蛋白

1. 孵育結(jié)束后，通過磁力架吸附磁珠，棄去上清液，保留磁珠復(fù)合物；

2. 向磁珠中加入預(yù)冷的洗滌緩沖液（去污劑濃度降至 0.1%，保護(hù)蛋白復(fù)合物不解離），輕輕渦旋混勻后，磁力架吸附磁珠并棄去上清；

3. 重復(fù)洗滌 3-5 次，若實驗背景過高，可增加至 5 次；最后-次洗滌后，用微量槍頭吸盡離心管底部殘留的洗滌緩沖液，避免稀釋后續(xù)樣品。
? 洗滌時動作輕柔，切勿吸走磁珠，防止目的蛋白丟失。

步驟 6：蛋白洗脫，獲得目的蛋白復(fù)合物

向洗滌后的磁珠復(fù)合物中加入 2×SDS 上樣緩沖液，渦旋混勻后，95℃金屬浴加熱 5-10min，使蛋白從磁珠 - 抗體復(fù)合物中洗脫并變性；加熱后短暫離心，吸取上清液，即可用于后續(xù)的 Western Blot（WB）驗證或質(zhì)譜（MS）鑒定。
遵循上述標(biāo)準(zhǔn)化流程，并結(jié)合預(yù)實驗優(yōu)化抗體用量和洗滌條件，您將能穩(wěn)定地獲得高質(zhì)量的免疫共沉淀數(shù)據(jù)，為蛋白質(zhì)功能研究提供可靠依據(jù)。

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