當(dāng)需要更高精度的細(xì)胞活性數(shù)據(jù)，或樣本中存在紅細(xì)胞、細(xì)胞碎片等干擾物時(shí)，AO/PI雙染法是優(yōu)于臺(tái)盼藍(lán)染色的“金標(biāo)準(zhǔn)"方法。它結(jié)合了兩種熒光染料的特性，結(jié)果清晰可靠。

染色原理

AO（吖啶橙）：是一種膜通透性熒光染料，能夠自由穿過(guò)所有細(xì)胞（活細(xì)胞和死細(xì)胞）的細(xì)胞膜，與細(xì)胞核內(nèi)的DNA結(jié)合后，在藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。

PI（碘化丙啶）：是一種膜不通透性熒光染料，只能進(jìn)入細(xì)胞膜受損的死細(xì)胞內(nèi)，與DNA結(jié)合后發(fā)出紅色熒光。

當(dāng)兩種染料同時(shí)存在時(shí)：

 活細(xì)胞：細(xì)胞膜完整，PI無(wú)法進(jìn)入。只有AO進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光。

 死細(xì)胞：細(xì)胞膜破損，AO和PI均可進(jìn)入。當(dāng)兩者同時(shí)與DNA結(jié)合時(shí)，由于能量共振轉(zhuǎn)移，PI的紅色熒光會(huì)掩蓋AO的綠色，最終細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色熒光。

操作流程與儀器

 染色：將AO和PI按一定比例（通常預(yù)混或依次加入）與細(xì)胞懸液混合，室溫避光孵育幾分鐘。

 檢測(cè)：

 熒光顯微鏡：將染色后的細(xì)胞滴片，在熒光顯微鏡下觀察。綠色細(xì)胞為活細(xì)胞，紅色細(xì)胞為死細(xì)胞，清晰可辨。此法可直接觀察細(xì)胞形態(tài)，但計(jì)數(shù)相對(duì)耗時(shí)。

 流式細(xì)胞儀：將細(xì)胞懸液上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。儀器可快速檢測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的熒光信號(hào)，并給出精確的活細(xì)胞/死細(xì)胞比例，同時(shí)可分析細(xì)胞大小、顆粒度等參數(shù)，效率高、客觀性強(qiáng)。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)與局限

優(yōu)勢(shì)：

 準(zhǔn)確性高：有效排除紅細(xì)胞（無(wú)核，不染色或染色弱）和細(xì)胞碎片（無(wú)完整細(xì)胞核，熒光信號(hào)弱）的干擾。

 雙熒光驗(yàn)證：活/死細(xì)胞信號(hào)對(duì)比鮮明，結(jié)果直觀可信。

 可結(jié)合流式：實(shí)現(xiàn)高通量、多參數(shù)的精確分析。

局限：

 設(shè)備依賴：需要熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀，并非所有實(shí)驗(yàn)室都具備。

 成本較高：熒光染料和配套耗材比臺(tái)盼藍(lán)貴。

 操作稍復(fù)雜：需要避光操作和儀器使用經(jīng)驗(yàn)。

應(yīng)用建議

AO/PI染色特別適用于：含有紅細(xì)胞的樣本（如組織消化液）、需要高精度數(shù)據(jù)的藥物篩選實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)中的死活細(xì)胞區(qū)分、以及作為發(fā)表論文的可靠數(shù)據(jù)支撐。

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